细胞学说提出“细胞是动物和植物结构和生命活动的基本单位”，只有充分了解细胞的特性与功能，才能深入理解生命现象的深层机制，才能明晰生物体生长发育的规律，才能辨明疾病发生发展的原因。单细胞测序（single-cell sequencing）在单细胞水平研究细胞的功能和细胞互作网络，帮助我们深层次理解生命机制。
2013-2020 年，单细胞测序技术多次被 Science、Nature 等学术期刊评价为年度重点技术，正引领新一轮生物医学领域的技术革命；在肿瘤、神经学、免疫、感染性疾病、生长发育和生殖健康等领域得到广泛应用。
提到单细胞测序，我们脑中更多浮现得是scRNA-Seq(single-cell RNA -sequencing)；scRNA-seq是目前常用的单细胞测序技术，但是逐渐呈现出一些固有的方法学问题：组织类型偏好（无法分析难解离的组织和冻存组织等）；在细胞悬液制备中会引入一些转录偏好；组织解离时得到易于解离下来的细胞，敏感的细胞可能在解离时破碎；目前商业化的单细胞平台都对细胞大小有限制等。
snRNA-seq(single-nucleus RNA-sequencing)以其独特的优势受到研究者的青睐，逐渐呈现出较为火热的景象。目前在多种动植物组织，如肿瘤组织[1]、脑[7]、肾脏[3]、心脏[8]和脂肪[4]中得到应用，在植物单细胞中也逐渐展现了其优势[5]。snRNA-seq是否可以和scRNA-Seq一样，得到一致的结果，解析生物学特征，两者之间有哪些差异，下面几篇文献可以略解您的疑虑，带您初识snRNA-seq。
scRNA-Seq和 snRNA-seq方法比较文献解析
1、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.
发表杂志：Nature Medicine
影响因子：36.13
发表时间：2020. 6. 25
实验平台：10x Chromium
实验材料：新鲜和冻存的8种肿瘤组织，如NSCLC（非小细胞肺癌）， NB（成神经细胞瘤），MBC（转移性乳腺癌），GBM（脑胶质瘤），CLL（慢性淋巴细胞白血病），Ovarian（卵巢癌），Melanoma（黑色素瘤）和肉瘤。
研究内容：开发了一种系统工具箱，可以分别通过scRNA-Seq和 snRNA-Seq对新鲜和冷冻的临床肿瘤样品进行分析；对同样的样品进行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析，结果显示它们可以得到相同的细胞类型，但是每种细胞类型的占比不同。
主要结果：
a. 建立了系统性的scRNA-Seq和snRNA-Seq的实验流程和数据分析流程
研究了8种不同类型的肿瘤组织，通过不同取样方式，共获得不同部位共23个标本的40个样品的216,490个细胞和细胞核，这些样品具有丰富的组织和样品多样性；对不同的细胞和细胞核分离方式，在实验和数据分析中对细胞/细胞核质量、细胞/细胞核回收率、灵敏度、细胞类型和CNV 分析等方面进行评估，确定了实验流程和数据分析流程（图1-1）；通过对8种肿瘤组织实验和数据分析结果比较，推荐了细胞和细胞核分离方式（图1-2）。
图1-1 sc/snRNA-Seq 实验和数据分析流程
图1-2 不同肿瘤组织样品信息和细胞/细胞核分离方式
对成神经细胞瘤（HTAPP-656）、转移性乳腺癌 (HTAPP-963)、CLL (CLL1) 和 O-PDX (O-PDX1)相同的样品同时进行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析。两种方法可以得到相同的细胞类型，但是每种细胞类型的占比不同；在成神经细胞瘤和转移性乳腺癌中，scRNA-Seq获得更多的免疫细胞，snRNA-Seq得到更多的恶性肿瘤细胞（图1-3）；细胞检测到解离信号的比例比细胞核高，且信号值较高；在细胞和细胞核中，免疫细胞和基质细胞的解离信号更加明显（图1-4）。
图1-3 scRNA-Seq and snRNA-Seq结果比较
图1-4 scRNA-Seq and snRNA-Seq解离信号比较
2.Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods
发表杂志：Nature biotechnology影响因子：36.558发表时间：2020. 4. 6实验平台：scRNA-Seq:低通量(Smart-seq2和CEL-Seq2）和高通量(10x Chromium、Drop-Seq、Seq-Well、inDrops和sci-RNA-seq)snRNA-Seq:Smart-seq2、10x Chromium、DroNc-Seq和sci-RNA-seq
scRNA-Seq：人（HEK293）和小鼠（NIH3T3）等比例混合细胞系和冻存人类PBMC（2个生物学重复）；snRNA-Seq：冻存小鼠大脑皮层（2个生物学重复）Bulk RNA-Seq：以上3种材料
研究内容：选择2种低通量和5种高通量方法进行scRNA-Seq或snRNA-Seq分析；为了直接比较、避免每种方法已有流程的影响，作者开发了一种更加灵活、适用于任何scRNA-Seq的方法“scumi”；通过比较reads的结构和比对情况、灵敏度、多胞率和解释已知的生物学信息评估每种方法；两种低通量方法表现相似，CEL-Seq2受其他细胞污染reads的影响比较明显；10x Chromium在高通量方法中表现更优。
首先，开发了“scumi”软件包，从FASTQ文件到产生适用下游分析的基因和细胞参数；其次，提出了下游分析前过滤低质量细胞的方案，这也是数据预处理的重要挑战，然后对每个实验类型每个细胞进行相同的reads数分析；最后，通过关键的参数对每种方法进行评估：①比对到细胞核和线粒体基因组的reads 及其结构；②捕获RNA的灵敏度；③多胞率；④准确性和重复性；⑤得到细胞类型中重要的生物学差异的能力（图2-1）。
图2-1 scumi数据分析流程
b. reads结构和比对到基因组的信息显示不同方法具有效率差异结果显示，不同的方法在预期的位置没有Poly（T）reads比例明显不同；外显子、内含子、基因间、重叠的差异基因、多重比对以及无法比对的reads不同方法间基本一致；但是细胞核中内含子reads与外显子reads的比率明显高于细胞，因为细胞核中有较高比例未剪切的转录本（图2-2）。
图2-2 测序reads的基因组比对特征（a. Mixture, b.PBMCs, c.Cortex ）
c. 不同实验每种方法的灵敏度相对一致
结通过分析每个细胞的reads数、UMIs 和基因数比较每种方法的灵敏度（即捕获RNA的能力）；7种方法中，低通量方法灵敏度最高，高通量方法中10x Chromium 每个细胞检测到的UMI和基因数最多（图2-3）。
图2-3不同实验每种方法的灵敏度比较
d. 不同的方法区别和获得细胞类型的能力不同
选择转录组分析方法最重要的一项指标就是这种方法能否解释感兴趣的生物学信息。为了更加公平的分析每种方法，我们对数据进行了一致性处理；选择相同的Reads/cell 和cells/实验进行细胞分群和细胞类型鉴定。
在PBMCs中，每种方法都可以获得丰富的细胞类型，但是每种类型的丰度不同，且获得稀有细胞类型的能力有差异（如浆状树突细胞）；每种方法都有一定程度的血小板污染。
在大脑皮层中，细胞核分析得到小鼠大脑皮层多种细胞类型，包括兴奋和抑制性神经元,星形胶质细胞,少胶质细胞,少突胶质祖细胞,小胶质细胞,内皮细胞和周皮细胞，其中周皮细胞只在DroNc-Seq Cortex1 中发现；sci-RNA-seq未得到少突胶质祖细胞和小胶质细胞（图2-4）。
图2-4不同实验不同方法细胞类型的比较
3.Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis
发表期刊：J Am Soc Nephrol
影响因子：9.274
发表时间：2019.1
实验平台：
scRNA-seq ：DropSeq
snRNA-seq：sNuc-DropSeq, DroNc-seq和 10x Chromium
实验材料：8周大的小鼠肾脏
研究内容：
在比较分析中共产生 11,391 个转录本。scRNA-seq鉴定了10个细胞簇，包括一个人为解离诱导的压力相应基因群，但是未鉴定到肾小球细胞。相反，3种snRNA-seq都鉴定到更加多样性的肾细胞类型，包括肾小球足细胞，系膜细胞和内皮细胞，未检测到压力响应基因；检测到的肾小球足细胞的比例是已知发表的scRNA-seq 数据的20倍（2.4% versus 0.12%）。更出乎意料的是，snRNA-seq和scRNA-seq 的基因检测灵敏度一致。为了验证snRNA-se方法的有效性，分析了经过纤维化和炎症UUO治疗第14天冷冻肾组织，鉴定了罕见近肾小球细胞，新活化的近端小管和成纤维细胞细胞状态，以及之前未知的肾小管间质信号通路。
图3-1 内含子对snRNA-seq 数据的影响
b. snRNA-seq鉴定了3个特有的细胞类型
将4种方法的数据整合分析，共鉴定了13个细胞簇，包括足细胞，内皮细胞和肾小球膜细胞；3种snRNA-seq 检测足细胞，内皮细胞和闰细胞的灵敏度更高；但是scRNA-seq未检测到任何足细胞。差异基因表达分析显示， 71.4% 基因在细胞和细胞核中都被检测到；在检测到的基因中，仅仅 5.0% 在细胞中的表达量高于细胞核，6.4%的基因在细胞核中的表达量高于细胞（fold change>1.5， P value <0.05）（图3-2）；scRNA-seq高表达基因包括线粒体、核糖体基因和热休克途径中的基因；snRNA-seq高表达基因包括溶质载体、转录因子和Non-coding RNA基因。
图3-2 snRNA-seq 和scRNA-seq 差异分析
c. snRNA-seq 分析经过纤维化和炎症UUO治疗的冷冻肾组织
图3-3 snRNA-seq 对UUO治疗冷冻肾组织的分析结果
snRNA-seq应用好文推荐
4. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis
发表信息：Nature；2020.10.28；IF：42.778。
单细胞平台：Smart-Seq2 和10x Chromium
推荐理由:
通过对小鼠和人进行单细胞核转录组分析，发现脂肪组织中的新的细胞类型P4；通过对marker基因Cyp2e1和Aldh1a1的深度分析确定P4的主要功能，如免疫荧光染色，基因过表达、基因敲除，共表达等功能验证技术。证明了这个亚群通过醋酸盐介导的调节其产热能力来调节邻近脂肪细胞的活动。人类脂肪组织中含有较高数量的该亚群细胞，这可能解释了与小鼠脂肪组织相比，人的产热活性较低的原因，并提示靶向该途径可用于恢复产热活性。
5. The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana
发表信息：bioRxiv preprint；doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156； 2020.07.28
单细胞平台：10x Chromium
推荐理由:
利用原生质体进行单细胞转录组测序困难重重，如原生质体获得困难（不同物种、不同发育时期和不同器官细胞壁成分不同），解离对基因表达的影响，原生质体细胞大小超出平台的限制等；为了克服原生质体的困难，作者进行了单细胞核转录组分析；与已经发表的文章相比，不仅验证了单细胞核转录组可以对拟南芥根进行分析，同时还发现了3种新的细胞类型；通过单细胞ATAC-Seq和snRNA-Seq 多组学联合分析揭示染色质重塑对基因转录的影响，证明细胞类型特异性标记基因也显示细胞类型特异性的染色质可及性模式。我们的数据表明，染色质的不同重塑是在细胞类型水平上调控基因活动的关键机制。
结束语
综上所述，snRNA-Seq 分析细胞核内的RNA，可以解释相应的生物学信息；snRNA-Seq 含有较多未剪切的转录本，包含内含子的序列进行分析，不仅可以提高提高RNA的捕获能力，同时可以得到更多的稀有细胞类型；snRNA-seq解决了scRNA-seq中固有的一些问题，能够获得更为准确可靠的结果。
近几年来，snRNA-Seq受到越来越多的青睐，文献增长趋势较为迅速；为特殊样品（如冷冻组织）的单细胞研究提供新的途径；为细胞单细胞研究开辟了新的思路。
snRNA-Seq和scRNA-Seq 是目前解析各种生命现象、揭示各种生物学机制的强有力的技术手段，各有千秋，研究者需要结合自身的条件来确定；如scRNA-Seq在神经小胶质细胞激活态（microglial activation）的研究中更胜一筹[6]。我们期待越来越多的研究者来解析单细胞转录学这浩瀚的星空，发现更多耀眼的星。
太阳集团电子游戏引进10xGenomics单细胞测序平台，使用Chromium系统采用微流控、油滴包裹和barcode标记等技术实现一次性分离、高效标记捕获；同时具有10x 单细胞转录组、单细胞核转录组、空间转录组、单细胞免疫组库、全长转录组测序，实现10x平台全面优质服务；已经具有大量单细胞分离捕获，极低量RNA反转录扩增建库成功经验；提供单细胞分离捕获、反转录建库、测序、标准分析和高级分析全套单细胞测序服务；强大的生信团队不仅提供基本分析，还提供细胞分化轨迹分析等多种高级分析；资深单细胞技术人员为您提供专业的课题方案设计，为您量身订造专属个性化分析。点击下方按钮联系我们，将可免费获得文章思路设计方案。
参考文献
[1]A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.Michal Slyper, Caroline B. M. Porter, Orr Ashenberg, et al .Nature Medicine ,May 2020,VOL 26:792-802
[2]Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods.Jiarui Ding, Xian Adiconis, Sean K. Simmons, et al.Nature Biotechnology,Nat Biotechnol. 2020 Jun,38(6):737-746
[3]Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis.Haojia Wu, Yuhei Kirita, Erinn L. Donnelly,et al.J Am Soc Nephrol,2019(30): 23-32
[4]snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.Wenfei Sun,Hua Dong,Miroslav Balaz, et al.Published online: 28 October 2020.
[5]Andrew Farmer1, Sandra Thibivilliers , Kook Hui Ryu, et al.The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana.bioRxiv preprint,doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156;2020.07.28
[6]Single-Nucleus RNA-Seq Is Not Suitable for Detection of Microglial Activation Genes in Humans.Nicola Thrupp, Carlo Sala Frigerio, Leen Wolfs, et al.Cell Reports , 2020(32):1-8
[7]Dissecting Cell-Type Composition and Activity_Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.Peng Hu, Emily Fabyanic,Deborah Y. Kwon, Sheng Tang,Zhaolan Zhou, Hao Wu.Molecular Cell.2017(68):1006–1015
[8]Systematic Comparison of High throughput Single-Cell and Single Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Diferentiation.Alan Selewa1, Ryan Dohn1, Heather Eckart, et al.Nature Scientific Reports | (2020) 10:1535
京公网安备 11011302003368号