单细胞全基因组测序（scWGS）重新揭秘阿尔茨海默病神经元的体细胞突变

阿尔茨海默氏病（AD）是一种常见、进行性和致命的与年龄相关的神经退行性疾病，其特征是神经元丢失和错误折叠蛋白质的定型沉积，但AD中细胞功能障碍的核心基础尚不清楚，AD尚未在单个细胞基因组层面进行检查。本期我们一起来追寻对AD和神经典型对照个体大脑的单个神经元应用了单细胞全基因组测序（scWGS）组学技术在遗传疾病方面的应用，希望能给大家对AD的研究带来新的思路。

研究背景

阿尔茨海默氏症的痴呆症随着神经变性的进展而发展，但导致神经元功能障碍和死亡的具体事件仍然鲜为人知。在正常衰老期间，神经元以类似于分裂细胞的速度逐渐积累躯体突变，这表明遗传因素、环境暴露或疾病状态可能会影响这种积累在这里，本文分析了来自阿尔茨海默病患者和神经典型对照个体前额叶皮层和海马体的319个神经元的单细胞全基因组测序（scWGS）数据。发现阿尔茨海默氏症患者的体细胞DNA改变增加，分子模式不同，正常神经元主要以与年龄相关的模式（特征A）积累突变，这与之前在健康和癌细胞中描述的“时钟状”突变特征非常相似。神经变性中DNA改变的异常积累为阿尔茨海默病发展过程中发生的分子和细胞事件的级联提供了见解。

材料方法

材料：年轻的神经典型对照组（9人）、老年神经典型对照组（11人）、阿尔茨海默氏病患者（9人）；一共29人，总计：319个神经元，172个PFC-MDA神经元，78个HC-MDA神经元，69个PFC-PTA神经元

方法：对319个神经元进行单细胞全基因组测序。

研究结论

AD患者大脑中的兴奋性神经元积累的基因组损伤——以及可能的永久性突变——超过了仅因衰老而发生的水平。AD神经元中基因组SNV积累的模式似乎与正常衰老的加重不同，这表现为（1）特征C的丰富，特征C存在于神经典型对照个体的大脑中，但有限；（2）特征特异性转录影响。这些基因组变化可能包括一系列表现形式，包括单链DNA病变和双链突变。AD神经元体细胞改变的具体模式还提供了关于其原因和AD发病机制潜在影响的线索并确定潜在的治疗目标，scWGS技术深度揭示AD疾病发病机制与体细胞突变的积累有关，为其治疗提供了理论基础。

主要研究结果

1、衰老期间神经元的体细胞突变

对从AD和神经典型对照个体的大脑中分离出来的神经元进行了单细胞全基因组测序（scWGS），染色了泛神经元标记NeuN来标记神经元，并进一步只标记了大的NeuN阳性核，使用多位移放大（MDA）进行全基因组扩增，分析了8例AD的91个神经元和18个神经典型对照组的159个神经元。在神经典型个体中，神经元sSNVs随着年龄的增长而增加，sSNVs的年增长率相当高，从每年13到55个sSNV不等，在一些特殊细胞类型中，分裂突变率更高。没有神经诊断的个体的海马CA1神经元显示，随着年龄的增长，sSNVs呈积累的趋势，这与神经典型对照个体前额叶皮层（PFC）神经元中看到的sSNV的增加没有显著差异。

在正常的PFC神经元中，与年龄相关的突变增加主要由某些C>T和T>C变化驱动，从PFC和海马锥体神经元的复合数据集中对sSNVs进行签名分解分析表明，签名A在每个神经元中的贡献随着年龄的增长而增加，每年获得15.0±1.2 sSNVs。这种与年龄相关的特征A突变的增加与PFC和海马锥体神经元相似（P = 0.18，线性混合模型），并且是正常神经元中与年龄相关的sSNV积累的主要驱动因素。转录可以通过转录相关损伤或无效修复使表达的位点对躯体突变敏感。

2、AD中的体细胞突变特征分析

评估了8名AD患者大脑神经元中sSNVs的负担，发现AD神经元sSNVs明显高于预期。AD神经元在MDA实验中也显示sSNVs显著增加。在PFC中，在八例AD个体病例中观察到AD中sSNVs相对于正常衰老的显著增加。AD中sSNV计数高的几个基因组来自海马体，其中8例中有5例与正常衰老相比，sSNVs显著增加。AD中的神经元包含数百种额外的sSNV，超出了其年龄的预期，这表明该疾病过程产生的基因组损伤水平与十多年来sSNV的正常积累相当。变异的广泛基因组分布表明，体细胞突变不是构成疾病发病机制的特定初始事件，而是继发性的，这是由引发AD和诱变过程的其他事件引起的。

AD神经元的突变特征分析，在所有样本中，A突变都会随着年龄的增长而增加，这表明这种时钟状特征（与癌症5的时钟样特征SBS5最相似）构成了基因组老化的固有特征。签名A还显示，相对于年龄匹配的控制，AD略有增加，这在这些MDA实验中没有达到统计学意义，但表明这些突变机制在疾病环境中可能会被强调。另一方面，AD神经元与对照组相比，签名C明显增加。鉴于AD4.31-33中报告了活性氧（ROS）和氧化核酸病变的增加，在AD中积累标志性C的合理机制是，氧化损伤的增加压倒了NER，而NER也可能在AD中也会减弱。

由于我们的突变特征分析表明，DNA氧化——之前在AD4.11患者大脑的批量分析中观察到——可能会导致AD中过量的sSNV，使用针对8-oxoG的抗体进行免疫荧光显微镜显示，AD神经元中的8-oxoG水平明显高于神经典型对照神经元。表明氧化核苷酸损伤水平的增加有助于C>A变化和AD神经元中标志性C的增加。

对神经元功能和生存至关重要的基因突变可能会直接影响细胞适应性，对于签名A，转录期间的事件似乎在产生突变方面发挥作用，而签名C与表达式成反比，因此可以在转录期间更有效地修复，包括通过TC-NER35修复。对AD和对照神经元中位突变的基因本体学（GO）分析显示，参与神经元功能的基因被sSNVs丰富。当与表达式-sSNV结果一起考虑时，AD神经元显示转录过程对突变生成的影响，这种转录影响可以在配对的DNA链上产生不对称的突变模式。

在蛋白质编码基因中，AD神经元表现出比年龄匹配的对照神经元表现出更多的非同义突变，对AD37脑脊液和脑组织中的克隆CD8+ T细胞的观察表明，这种自激活可能与AD有关。功能失调的神经元在AD中会明显更丰富，这可能会因某些AD相关基因的长度而加剧；因此损害神经元功能可能是sSNVs影响细胞生理学的一种方式。

3、PTA扩增对AD神经元基因组突变特征分析

基于PTA（初级模板定向放大）的人类神经元scWGS证实，体细胞突变随着年龄的增长而增加。对MDA分析的大多数大脑的神经元小样本（来自7例AD的29个神经元和13个神经典型对照组的40个神经元）进行了基于PTA的scWGS，并确认AD神经元与对照组相比包含更多的改变，PTA检测到的sSNVs代表双链体细胞突变。
PTA检测到的突变，这再次证实了签名A突变以时钟般的方式随着年龄的增长而增加，AD神经元中的签名A略有显著增加（P = 0.04，线性混合模型）。AD神经元总突变的增加一样，PTA突变特征发现反映了MDA放大神经元基因组的趋势。其中包括SBS8和SBS30，它们与DNA修复酶NTHL1有关，NTHL1参与氧化性病变修复。转录区域PTA检测到的sSNVs负荷与大脑中的基因表达水平相关，而签名A和C突变显示的模式与MDA检测到的sSNV相似，指出转录活动对突变发生的特殊影响。因此，两种scWGS方法都确定了类似的模式，并表明AD中的致病突变机制包括DNA氧化、NER DNA修复和转录活性。

总结

两种不同的单细胞全基因组测序技术揭示了AD患者大脑中的兴奋性神经元积累的基因组损伤——以及可能的永久性突变——超过了仅因衰老而发生的水平，未来探索更多的体细胞突变模式解释这些氧化性病变如何通过与衰老过程中发生的突变相互作用来损害基因组功能。

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