Nat Genet项目文章｜高质量玉米抗旱种质基因组组装及遗传解析

2023年2月21日，中国农业大学秦峰教授团队在Nature Genetics在线发表了题为“Genome assembly and genetic dissection of a prominent drought-resistant maize germplasm” 的研究论文。报告了玉米抗旱优良种质基因组CIMBL55组装和注释结果，揭示其优良抗旱性的遗传基础。中国农业大学秦峰课题组博士后田甜和博士生王书会为论文共同第一作者，中国农业大学秦峰教授为通讯作者。太阳集团电子游戏完成了PacBio、Hi-C测序及相关分析工作。

研究背景

干旱是制约作物生产的主要逆境因素之一，由于全球气候变化，自然灾害频发，极端天气难以预测，培育高产、抗逆的作物品种的需求比以往任何时候都更加迫切。玉米(Zea mays)在世界各地广泛种植，是一种具有巨大现代经济重要性的植物，可作为食品和替代能源。然而玉米特别容易受干旱的影响，据估计，世界上只有约不到5%的玉米种质资源在美国的育种项目中得到利用，表明玉米中存在着多种多样的遗传资源，可能是培育抗旱品种的优良来源。

目前，还未有优良抗旱玉米种质基因组被破译，鉴定玉米抗旱种质资源，对进一步解析玉米抗旱性的遗传基础提供依据，对玉米抗旱性的遗传改良具有重要意义。

材料方法

基因组：60×RSII、100×Sequel 2、160×BioNano、35×Hi-C

遗传变异研究：CIMBL55、25个NAM Founder lines、SK、Mo17、K0326和A188基因组间变异研究

甲基化：CIMBL55、B73和Mo17全基因组亚硫酸氢盐测序(BS-seq)

研究内容

CIMBL55基因组的组装与注释

CIMBL55与B73玉米基因组的基因共线分析

玉米基因组间遗传变异对抗旱性的影响

表观遗传变异对玉米抗旱性的影响

ZmRtn16基因对玉米抗旱性的影响

主要研究结果

1.CIMBL55基因组的组装与注释

热带/亚热带（TST）玉米种质CIMBL55具有显著的抗旱性，在干旱胁迫条件下，与B73和Mo17相比，CIMBL55的苗期存活率高，产量损失小（图1a-d）。本研究结合PacBio、Illumina、Hi-C和BioNano光学图谱等技术对其进行基因组组装，最终组装基因组大小为2,159.5Mb，contig N50为14.3Mb，scaffold N50为223.6Mb，随后，通过Hi-C技术将scaffold挂载至10条染色体上（图1e）。BUSCO分析表明，~98%的基因是完整存在的。随机挑选9个BAC序列与基因组组装比对表明，两者具有很好的序列同源性。这些结果表明CIMBL55基因组具有高度完整性和准确性。CIMBL55、B73、Mo17和SK（另一种TST种质）基因组共线性分析发现，在B73和CIMBL55间存在大的易位、重复和倒位事件；与B73和Mo17相比，CIMBL55和SK在Chr7上有~440 kb的缺失，在Chr8上有~560 kb的插入，表明这些差异可能在TST种质中普遍存在。

基于从头预测和同源比对预测对CIMBL55基因组的重复区域进行注释，发现83.95%的基因组序列为转座子元件。基于从头预测、同源比对预测和转录组辅助预测在CIMBL55中共注释了38,439个基因，平均基因长度为4,289 bp。Circos图显示跨越染色体臂的DNA-TEs和蛋白编码基因的分布模式相似，RNA-TEs的分布与着丝粒较高的CG和CHG甲基化有关。

2. CIMBL55与B73玉米基因组的基因共线分析

基因共线性反映了不同基因组间的基因含量及其在染色体上的排列。CIMBL55与B73基因组之间的共线基因分析表明，73%的CIMBL55基因位于共线基因块，27%的基因是非共线基因。共线基因进一步可以分为三类。1类基因(42%)位于B73和CIMBL55的同源染色体上，多数为单拷贝基因(one-one syntenic)。2类基因(29%)是位于各自基因组中两条不同同源染色体上的重复基因(multi–multi synteny)（图2b）。3类基因(2%)位于CIMBL55当前组装中未定位到染色体上的contigs中，但与B73中的相应基因处于共线性块中。非共线基因包括class 4(16%)和class 5(11%)2类基因。

RNA-seq分析发现，共线基因比非共线基因具有更高的转录丰度，表明基因组重排可能影响了基因的表达（图2d）。玉米祖先经历了全基因组复制事件，然后是偏分镏和二倍化。参考高粱基因组，构建了CIMBL55的亚基因组，发现其偏分镏与B73一致，支持了玉米进化过程的保守性。在CIMBL55的两个亚基因组中，有61.5%的2类基因为成对保留的，表明2类基因在玉米进化过程中保持相对保守。GO分析发现，这些基因在多种胁迫的应激反应中显著富集。进一步对与ABA信号和干旱响应相关基因家族分析发现，72%的基因属于2类基因，显著高于全基因组水平上的2类基因（29%）。这些结果表明，在玉米进化过程中，参与环境响应和适应的基因倾向于成对保留。

3.遗传变异对抗旱性的影响

为了确定CIMBL55抗旱性的遗传机理，本研究在泛基因组水平上研究了25个NAM建立系和另外4个玉米品系SK、Mo17、K0326、A188的遗传变异。共得到17,581,014个结构变异(SVs)（图3a）。为了更深入地了解CIMBL55的基因组变异，以CIMBL55为参考，在B73和Mo17中鉴定到841,911个DNA变异(>20 bp)。随后，在368份玉米自然群体中，成功对544,853个SVs进行了基因型鉴定，并基于干旱后的幼苗存活率对其耐旱性进行了分析。

此前研究中，基于全基因组关联分析(GWAS)和孟德尔随机化分析分别鉴定了42个和97个抗旱性候选基因。作者在CIMBL55基因组中对这些位点的基因型进行研究，鉴定得到108个抗旱基因。值得注意的是，在CIMBL55中发现了65个基因的优异单倍型，解释了CIMBL55优良抗旱性的遗传基础。此外，在108个基因中，有11个候选基因在非CIMBL55等位基因中被鉴定为优势单倍型，这表明其他种质可能含有与CIMBL55互补的玉米抗旱性遗传资源（图3b）。

研究发现，位于ZmABF4基因第二内含子的SNP (S1474)和SV (S3205, 42 bp)与该基因的表达和苗期抗旱性密切相关。ZmABF4编码bZIP转录因子，为ABA和干旱诱导表达的主要调节因子。携带ZmABF4^CIMBL55等位基因的种质在基因表达和抗旱性方面明显高于携带ZmABF4^B73等位基因的种质（图3d, e）。转基因过表达分析发现，与野生型(WT)相比，ZmABF4转基因株系在干旱胁迫下存活率显著提高，叶片失水率降低（图3f-h）。说明ZmABF4对玉米抗旱性具有正向调控作用， ZmABF4^CIMBL55可能是玉米抗旱性的优异等位基因。

4.表观遗传变异对抗旱性的影响

对B73、Mo17和CIMBL55三个材料进行全基因组亚硫酸氢盐测序(BS-seq)，准确评估其基因组的DNA甲基化状态。mCG和mCHG的甲基化水平在全基因组中较高，但在基因边界处明显下降。相比之下，包括RNA-TE区域在内的基因组中mCHH水平普遍较低，而DNA-TE元件中mCHH水平较高，表明在这两种类型的TEs中，CHH甲基化的调控机制不同。

基于CIMBL55和B73基因组序列，鉴定SV相关基因组区域的差异DNA甲基化。在CIMBL55中鉴定到5,346个插入序列用于SV相关DNA甲基化分析。根据mCG、mCHG和mCHH的水平，将插入序列的DNA甲基化模式聚类为5组（图4a-c）。其中cluster 4插入片段的mCG、mCHG和mCHH水平明显高于侧翼序列（图4b, c）。并且邻近基因的转录起始位点的插入序列具有显著高的CHH甲基化水平，富集了大量的DTH (DNA Transposon terminal inverted repeat Harbinger)类转座子（图4b）。

在ZmNAC075的启动子区域发现了差异DNA甲基化。CIMBL55和B73的基因组序列比较发现，在ZmNAC075^B73的上游区域有两个插入序列，具有较高的甲基化状态。此外，携带ZmNAC075^B73等位基因的种质在干旱胁迫下的基因表达水平和幼苗存活率明显低于携带ZmNAC075^CIMBL55等位基因的种质（图4e,f）。CRISPR靶向基因敲除结合全基因组BS-seq分析显示，发现两个插入序列的CHH高甲基化状态可能抑制基因表达进而影响抗旱性（图4l）。

5.ZmRtn16可以显著提高玉米的抗旱性

另外，基因组结构变异分析发现CIMBL55中ZmRtn16的3′-UTR区域缺少一个28bp的插入序列，该变异与干旱胁迫后的幼苗存活率密切相关（图5d）。表型分析发现，该变异影响基因表达和抗旱性（图5e, f）。分别从B73和CIMBL55中克隆了3’-UTR序列（包含一个先前确定的显著SNP和28 bp的SV）。分析发现28 bp的插入有利于增强ZmRtn16的表达丰度，而SNP对其没有影响。

进一步构建ZmRtn16过表达转基因株系，发现其比WT具有更好的抗旱性（图5h）。而两个CRISPR基因敲除株系中抗旱性较差（图5i）。过表达株系叶片失水率较低，叶片气孔小；而KO株系叶片失水率较高，叶片气孔更大（图5h-i）；表明过表达株系的抗旱性与气孔大小相关。比较ZmRtn16-OE、zmrtn16-crispr和WT株系的表型，发现在干旱条件下，ZmRtn16-OE的抗旱性更好（图5j）。以上结果表明ZmRtn16在植物抗旱性中发挥了积极作用。

为了解ZmRtn16的生物学功能，亚细胞定位分析发现ER标志物与ZmRtn16-GFP融合蛋白共定位在ER中，表明ZmRtn16-GFP在ER中发挥作用。免疫共沉淀(co-IP)显示ZmRtn16能与液泡膜H⁺-ATPase复合体A (ZmVHA-A)和E3亚基 (ZmVHA-E3)相互作用。随后，通过比较zmrtn16-crispr和WT株系的ZmVHA-A和ZmVHA-E3亚细胞定位，发现ZmRtn16可以促进ZmVHA-A和ZmVHA-E3的液泡膜定位（图6c）。此外，与WT植物相比，ZmRtn16-OE株系液泡质子泵活性较高，而ZmRtn16-KO株系液泡质子泵活性较低（图6e），突出了液泡质子泵在抗旱性上的作用。综上所述， CIMBL55基因组中ZmRtn16基因3′ -UTR中28 bp缺失，可能增强ZmRtn16的表达，促进了ZmVHA-A和ZmVHA-E3在液泡膜中的定位，从而提高玉米的抗旱性。

总结

本研究构建了一个高质量的抗旱玉米种质CIMBL55的基因组。结合已发表的30个玉米自交系基因组在泛基因组水平上进行遗传变异分析，在108个先前鉴定的抗旱基因中，CIMBL55中至少携带了65个优异等位变异，这可能是构成CIMBL55优良抗旱性的遗传基础。值得注意的是，编码一种网状样蛋白（reticulon-like protein）的ZmRtn16通过促进液泡H⁺– ATPase活性来增强抗旱性，突出了液泡质子泵在玉米抗旱性中的作用。总之， CIMBL55基因组的组装为玉米抗旱性的遗传解析和改良提供了基础，为我国和全球的粮食安全提供了支持。