成功案例 | CPSF4在肝细胞癌中调节circRNA形成和microRNA介导的基因沉默

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导读

circRNA在多种生理过程中发挥着重要作用，因此许多疾病与circRNA有关，特别是癌症。前期已有大量研究发现肝细胞癌（HCC）中circRNA表达普遍下调，pre-mRNA 3′ 末端复合物参与circRNA环化并在 HCC 肿瘤发生中起重要作用。因此，本研究探索了CPSF4在circRNA 3′ 末端形成和剪切中的作用。临床研究表明，CPSF4在HCC中表达上调，CPSF4的高表达与HCC患者的不良预后相关。机制研究表明，CPSF4导致具有多聚腺苷酸化信号序列的circRNA降低，这类circRNA的减少导致miRNA的降低并破坏了HCC中miRNA介导的基因沉默。细胞培养和异种移植小鼠模型的实验表明，CPSF4促进HCC细胞的增殖并增强致瘤性。综上，在HCC中CPSF4通过抑制circRNA和破坏miRNA介导的基因沉默引发癌症。

实验方法

材料：5位术前未经治疗的HCC患者癌组织和癌旁组织样本；TCGA数据库数据

方法：转录组测序、circRNA测序、细胞迁移实验、生存分析

研究结果

1、circRNAs在HCC组织中下调

为了探索HCC中的circRNA表达谱，本研究分析了几个公开可用的数据，包括GSE94508、GSE97332和GSE14520，结果显示在3个GEO数据库中，HCC的circRNA表达水平下降。尽管通过选择性剪接和多聚腺苷酸化导致广泛的RNA缩短是癌症中的常见现象，但circRNA的长度分布没有改变，并且所有长度的circRNA表达水平都下降。PAS序列是多聚腺苷酸化剪切的核心元件，分析表明HCC组织中的circRNA无论是否含有PAS序列均显著下调。然而，在3个GEO数据库中，含有PAS的circRNA的平均水平显著低于不含PAS的circRNA，这表明PAS介导的剪切在circRNA形成中起重要作用。综上所述，HCC组织中circRNAs整体减少，PAS介导的RNA裂解可能是导致circRNA下调的原因之一。

2、CPSF4高表达与HCC患者的不良预后相关

由于CPSF4表达在HCC中显著增加，并且其高水平表达对应于HCC中OS的最高风险，因此本研究将重点放在CPSF4上。通过比较50对配对的序列数据，发现HCC肿瘤组织中CPSF4表达水平显著高于正常邻近组织。来自GSE49515的微阵列数据还表明，10名HCC患者的外周血单核细胞（PBMC）样本中的CPSF4水平显著高于10名健康对照，这表明CPSF4可以作为HCC诊断的生物标志物（图 1A）。Kaplan-Meier对364例患者的生存分析显示，5 年生存率从 CPSF4低表达患者的57%±5%下降到CPSF4高表达患者的42%±5%（p < 0.01，图 1B）。进一步的相关分析表明，CPSF4与临床TNM分期、病理分级和临床分期显著相关（图 1C）。单变量分析表明HCC患者的OS率与高CPSF4表达之间存在关联（p < 0.01）。多变量Cox回归分析显示CPSF4水平（p = 0.03）是OS的独立预后因素（图 1D）。

通过对临床标本的分析进一步验证了生物信息学结果。本次检测的5个样本中，CPSF4的蛋白质印迹显示，与癌旁组织相比，HCC癌组织中表达更高（图 1E）。此外，细胞系中CPSF4的蛋白水平也显示CPSF4在所有HCC细胞系（Hep3B、Bel7402、Huh7、HepG2和Bel7404）中均高表达，但在正常肝细胞L02中几乎检测不到（图 1F）。在5个HCC细胞系中，HepG2的CPSF4表达水平最高，而Bel7402的水平最低。在Bel7402和HepG2细胞中构建了CPSF4敲低和过表达细胞，但由于Bel7402中的CPSF4表达非常低，所以无法检测到Bel7402-KD细胞中的敲低效率；虽然HepG2中的CPSF4表达非常高，但在HepG2-OE细胞中的过表达效率也非常低。因此，大部分CPSF4 KD实验是在HepG2细胞中完成的，而大部分CPSF4 OE实验是在Bel7402细胞中完成的。由41对组织样本组成的人类HCC组织微阵列的免疫组化（IHC）染色结果也证实了HCC组织中CPSF4的上调。在41个患者中，25个HCC组织表现出CPSF4高表达。相比之下，大多数癌旁组织显示出弱或中等的CPSF4表达（图 1G）。相关性分析还表明，CPSF4表达与临床TNM分期、病理分级和临床分期显著相关（图 1H）。

图1 CPSF4在HCC组织中高表达，并提示HCC患者预后不良

3、CPSF4降低HCC细胞中circRNA的表达水平

由于CPSF4负责PAS剪切，因此本研究假设CPSF4的增加加速了circRNA的降解并降低了它们在HCC细胞中的水平。为了验证这一假设，提取CPSF4-KD HepG2细胞、CPSF4-OE Bel7402细胞及其阴性对照的总RNA，并通过高通量测序进行分析。结果显示，在CPSF4-OE细胞中检测到下调circRNA（1058）多于上调circRNA（821），并且circRNA的平均表达水平显著降低。相比之下，CPSF4-KD细胞中大多数circRNA（5005个circRNA中的3221个）上调，circRNA的平均表达水平显著增加（图2A，B）。通过生物信息学分析发现，CPSF4主要抑制外显子circRNA，只有一小部分circRNA是内含子或内含子-外显子circRNA。CPSF4-OE细胞和CPSF4-KD细胞中circRNA的长度分布均未改变（图 2C），但CPSF4调节后的circRNA变化依赖于PAS。首先，在4种细胞系中，含有PAS的circRNA的表达显著低于不含PAS的circRNA；其次，CPSF4-KD细胞含有PAS序列的circRNA明显上调，但在没有PAS序列的circRNA中没有检测到变化（图 2D）。而在CPSF4-OE细胞中带有或不带有PAS序列的circRNA都减少了，推测在高表达水平CPSF4的存在下，除了6个传统PAS序列之外的一些非特异性PAS序列也可以被剪接。

为了验证，本研究首先从GEO数据库中选择了HCC组织中807个下调的circRNA（FC>2，p<0.05）；然后从RNA-seq数据中筛选了1447个在CPSF4-OE细胞中下调或在CPSF4-KD细胞中上调的circRNA。这两组数据取交集，共得到24个circRNA作为验证的候选circRNA；结构分析表明其中16个含有PAS序列。实时PCR结果显示，这16个circRNA中有13个在CPSF4-OE细胞中被抑制，但在CPSF4-KD细胞中被激活（图 2E）。选择2个带有PAS元件的circRNA，hsa_circ_0027774 和 hsa_circ_0004913 作为CPSF4靶向的circRNA；同时，另一个广泛研究的不含PAS元件的circRNA hsa_circ_0001946作为CPSF4非靶向circRNA。Northern blot结果表明hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913与CPSF4呈负相关，但hsa_circ_0001946在所有细胞系中保持相同水平（图 2F）。同时构建了这三种circRNA的OE质粒并与CPSF4 OE或KD质粒共转染，real-time PCR结果显示带有PAS的circRNA（hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913）与CPSF4水平呈负相关，而不含PAS的circRNA（hsa_circ_0027774和hsa_circ_0004913）不受CPSF4的影响（图 2G），这说明CPSF4在转录后抑制了circRNA。总之，CPSF4直接调节HCC细胞中带有PAS元件的circRNA的表达。

图2 CPSF4可减少HCC细胞中的circRNA生物合成

4、CPSF4介导的circRNA减少可以导致miRNA的减少并破坏miRNA介导的基因沉默

为了测试CPSF4介导的circRNA减少是否会影响miRNA的稳定性，从CPSF4-OE和CPSF-KD细胞中提取总miRNA，结果显示CPSF4-OE细胞中miRNA（4-40 nt）和tRNA（40-80 nt）的比率降低，但在CPSF4-KD细胞中增加（图 3A-C），这证实了CPSF4能够减少miRNA的积累。

与其他癌症一样，HCC中的miRNA表达水平整体下降。大多数下调的miRNA与本研究之前筛选的807个下调的circRNA互补。选择与hsa_circ_0004913部分互补的hsa-miR-383-5p、hsa-miR-142-5p，以及与hsa_circ_0027774部分互补的hsa-miR-450b-3p和hsa-miR-145-5p作后续分析。实时PCR显示4种miRNA在CPSF4-KD细胞中均增加，而在CPSF4-OE细胞中减少（图 3D）。HepG2细胞中的circRNA探针证实hsa-miR-145、hsa-miR-450b与hsa_circ_0027774结合，而hsa-miR-142、hsa-miR-383与hsa_circ_0004913结合。AGO2免疫沉淀（RIP）结果显示hsa_circ_0004913、hsa_circ_0027774及其结合的miRNA在AGO2抗体相关复合物中特异性富集，但在对照IgG中没有富集。在CPSF4-KD细胞中，与对照相比hsa_circ_0004913/has-miR-383和hsa_circ_0027774/hsa-miR-145对增加；但在CPSF4-OE细胞中减少，这表明CPSF4介导的circRNA减少也影响了miRNA的积累。miR-383直接靶向HCC中的PARP2，而PARP2参与HCC的发展；miR-145直接靶向CDCA3，CDCA3降低了HCC患者的生存时间。荧光素酶测定证实miR-145可以沉默CDCA3的表达，miR-383可以沉默PARP2的表达。生物信息学分析显示，PARP2的3′-UTR中有2个miR-383结合位点，CDCA3的3′-UTR 中有2个miR-145结合位点。此外，这2个基因在HCC中均过表达，并与HCC患者较短的OS相关。通过蛋白质印迹检测，发现PARP2和CDCA3蛋白也在CPSF4-KD细胞中降低，而在CPSF4-OE细胞中增加（图 3E）。此外，这2种蛋白的表达与HCC中CPSF4的表达呈正相关。所有这些数据都证实了CPSF4介导的circRNA减少破坏了miRNA介导的基因沉默。

 

图3 CPSF4减少了miRNA的积累和基因沉默

5、CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的肿瘤抑制作用

在Bel7402和HepG2细胞中生成hsa_circ_0004913-OE细胞，然后用CPSF4质粒转染。分别通过蛋白质印迹和实时PCR检测每个细胞系中的CPSF4蛋白和hsa_circ_0004913表达水平（图 4A，B）。与对照细胞相比，hsa_circ_0004913-OE细胞显示出较慢的增殖和较低的克隆形成。然而，CPSF4的OE可以消除hsa_circ_0004913的肿瘤抑制作用，因为CPSF4转染后生长速度和克隆形成能力恢复（图 4C，D）。这些结果表明circRNA在CPSF4介导的HCC细胞肿瘤发生中的重要作用。

图4 CPSF4拮抗hsa_circ_0004913的肿瘤抑制作用

文献下载：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34103682

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