单细胞测序应用于早期前列腺癌的诊断和分层

研究背景

前列腺癌高度的瘤内异质性和复杂的细胞起源极大地限制了传统的RNA测序在疾病诊断和分层中寻找更好的生物标志物方面的效用。基于组织标本的单细胞RNA测序在识别新的生物标志物方面具有很大的前景，但是这项技术还未被用于前列腺癌异质性的研究。

实验方法

采用单细胞RNA测序法鉴定细胞类型及相应的标记基因，通过拷贝数变异分析和伪混池测序的差异表达基因分析对不同聚类的恶性程度进行评价。通过标记基因的ROC曲线来评估前列腺癌的诊断和分层。免疫组化证实了标记基因的表达特征。

实验结果

一、PCa的scRNA序列分析和细胞分型

两名患者通过前列腺组织中AMACR的过度表达和TP63的缺失表达被诊断为PCa。收集两名患者的癌样，解剖并消化成单个细胞，用10×基因组学进行scRNA-seq（图1a）。共有7904个合格细胞用于进一步分析。通过PCA对所有细胞进行无偏聚类，UMAP可视化细胞成分（图1b）。通过DEG分析确定了15个主要簇的特征基因：T细胞、内皮细胞、1型管腔细胞、2型管腔细胞、红细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、3型管腔细胞、肥大细胞、基底细胞、成纤维细胞、间充质细胞、B细胞和神经内分泌细胞（图1c）。

Fig1 通过单细胞测序鉴定PCa中不同的细胞类型。

在本文的数据中，根据管腔标志物在PCa样本中的高表达水平，确定了3种类型的管腔细胞，包括角蛋白8（KRT8）和角蛋白18（KRT18）。为了表征这些管腔簇，作者用VlnPlot和FeaturePlot分别检测了各自标记基因的表达模式。结果表明，这些溶解酶（k4a）可作为特异性的载体（k4a）表达于细胞内（k4a4）。铜蓝蛋白（CP）在2型管腔细胞中唯一表达，而细胞维甲酸结合蛋白2（CRABP2）在间充质细胞以及2型和3型管腔细胞中高表达，这表明CP更适合2型管腔细胞（图2a，b）。与其他簇相比，3型管腔细胞表现出更高水平的β-1,4-半乳糖基转移酶1（B4GALT1）和干扰素α诱导蛋白6（IFI6）的表达水平，表明B4GALT1和IFI6可以识别这些细胞（图2a，b）。为了研究PCa组织中每种类型管腔细胞的细胞学定位，我们使用抗SLC45A3、抗CP、抗B4GALT1抗体进行免疫染色，并用DAPI复染组织切片（图2c）。SLC45A3在前列腺组织的大多数管腔细胞中表达（图2c）。相反，在一小部分管腔细胞中检测到低表达水平的SLC45A3（图2c）。不同类型的癌细胞在T1区的发育不完全相同（图2 c）。

Fig2 应用scRNA-seq分析和免疫组化检测PCa组织中不同管腔簇特异性标记基因的表达水平。

二、PCa中恶性管腔细胞的鉴定

为了评估已识别管腔簇的恶性程度，根据基因组间隔的平均表达模式对每种细胞类型的CNV水平进行分析。大多数非管腔细胞显示极低的CNV水平，除了红细胞和成纤维细胞，它们呈现中等CNV水平。

作者用edgeR软件包进一步检测了这些细胞的基因表达模式。1型管腔细胞显示PCa标记物（包括FOLH1、KLK3和神经肽Y（NPY）的表达水平更高。相反，2型管腔细胞表现出PCa抑制相关基因Latexin（LXN）和分泌性白细胞肽酶抑制剂（SLPI）的高表达，这些基因的缺失通常在PCa中检测到，并且与PCa患者的阴性预后相关。然而，前向梯度2（AGR2）是PCa的尿标志物，也在2型管腔细胞中高表达，表明2型管腔细胞并非完全正常细胞。3型管腔细胞表现出C-C基序趋化因子配体3（CCL3）、C-X-C基序趋化因子配体1（CXCL1）和Dickkopf-WNT信号通路抑制物1（DKK1）的高表达，这些细胞在PCa中的表达水平增加，并与骨转移和PCa的侵袭性有关。综上所述，1型和3型管腔细胞簇是由在PCa发生和发展中起不同作用的恶性细胞组成，而2型管腔细胞则是正常的前列腺上皮细胞。

Fig3 每个管腔团簇的DEGs和富集过程

为了进一步确定每个管腔簇在PCa发生和发展中的潜在作用，作者进行了功能增强。1型管腔细胞上调的基因主要富集于参与癌症进展的代谢过程，如脂肪酸代谢过程、甾体生物合成过程和肽类激素分泌，表明1型管腔细胞确实是恶性细胞（图3a，d）。2型细胞中蛋白水解酶和胞浆蛋白水解活性均为阳性，提示细胞内蛋白水解活性和2型细胞的高表达有关。有趣的是，2型管腔细胞中其他高表达的基因在正常前列腺发育过程中丰富，包括表皮发育、表皮细胞分化和对类固醇激素的反应（图3b，e）。综合起来，2型管腔细胞被鉴定为恶性程度相对较低的细胞。为了进一步验证这一观点，我们对从成对比较中获得的每个亮度DEG进行GO分析，并得到类似的结果。在3型管腔细胞中表达的上调基因主要参与肿瘤迁移相关的过程，如血管生成、上皮-间质转换的正调控和内皮细胞的发育，表明3型管腔细胞也是恶性细胞（图3c，f）。

三、PCa上皮细胞在肿瘤进展过程中的拟时间轨迹分析

PCa通常以管腔细胞扩张和基底细胞丢失为特征，因此认为管腔细胞是PCa中肿瘤细胞的起源。有研究证明来源可能并非来自管腔细胞，因为原发性良性前列腺组织的基底细胞可诱导免疫缺陷小鼠前列腺肿瘤的发生。为探讨PCa肿瘤发生过程中肿瘤细胞的来源，采用拟时间轨迹分析法。

Fig4 利用基底细胞和管腔细胞重建癌细胞的假时间轨迹，并识别在该轨迹中变化的基因。

进一步用基底细胞和3种管腔细胞进行检测。基底细胞和2型管腔细胞显示在轨迹的开始（图4a，b）。3型管腔细胞出现在轨迹分支1的末端，1型管腔细胞出现在轨迹分支2的两端（图4a，b）。这些结果表明基底细胞和2型管腔细胞都可能是PCa的始发细胞，并可能在PCa的发展过程中转化为2种不同类型的恶性管腔细胞。

作者进一步分析了基因沿轨迹的动态表达变化，以确定PCa进展的关键基因。表达变化最显著的基因包括：酸性磷酸酶、前列腺（ACPP）、激肽释放酶相关肽酶2（KLK2）、KLK3、角蛋白15（KRT15）、基质金属肽酶7（MMP7）和NPY（图4c）。此外，作者对前100个基因进行了拟时间表达模式的聚类分析，并分析了每个簇的功能丰富程度。聚类1中的基因高度表达于终末期，主要富集于PCa起始和进展相关的过程，包括细胞修饰的氨基酸代谢过程、激素分泌和AR信号通路（图4d）。第二类基因在前列腺发育初期表现出高表达水平，主要参与表皮发育和表皮细胞分化，提示其在前列腺正常发育中的潜在作用（图4d）。聚类3中的大多数基因在假时间轨迹的中间阶段表达增加，并在细胞趋化性中富集（图4d）。

四、PCa中恶性管腔细胞亚群的研究

作者首先分析来自TCGA的公共PCa患者中每个管腔标志基因的表达水平，以检验它们与PCa发生和发展的临床相关性。相比之下，大多数1型管腔标记基因在恶性程度较低的前列腺癌中的表达高于恶性程度高或正常前列腺，这表明在前列腺癌的发生和早期发展中有潜在的作用（补充图5）。因此，作者对1型管腔细胞进行了亚聚类，以确定引起PCa的亚群。PCA将1型管腔细胞分为5个亚组（图5a，b）。分析每个亚组标记基因的功能富集，亚组1与肿瘤细胞有丝分裂准备所必需的生物分子代谢过程有关，如脂质代谢过程和有机酸代谢过程（图5c）。与其他亚组相比，亚组2与细胞运动、管形态发生和细胞死亡负调控有关，这些过程对肿瘤的迁移和生长至关重要（图5c）。亚组3主要参与G蛋白偶联受体信号通路和肌肉组织发育（图5c）。第4亚组与PCa相关的过程，包括激素水平的调节，激素转运和肽激素转录（图5c）。相比之下，第5亚群的独特功能主要集中在细胞生长（图5c）。VlnPlot和特征图显示，AMACR、甘氨酸钠基转移酶样1（GLYATL1）和PCA3在5亚组中特异表达（图5d，e）。有趣的是，AMACR是一种在前列腺癌中高度表达的过氧化物酶体酶，参与支链脂肪酸和胆汁酸中间产物的β-氧化，对PCa的发生和发展至关重要。PCA3是一种非编码RNA，在PCa细胞系、原发组织甚至PCa患者尿液中高表达。这两个5亚组的标记物已经被用于PCa的诊断和分层，这意味着5亚组可能是临床上PCa诊断和分层所必需的一组不同的细胞。

Fig5 PCA对1型管腔细胞亚群进行亚群聚类。

五、Ⅰ型管腔细胞的5亚群是PCa诊断和分层的关键

分析TCGA患者Ⅰ型管腔亚群的临床相关性及其标记基因的表达模式。正常前列腺中大多数1-4亚组标记基因的表达水平与PCa组织中的相似甚至更高。相比之下，第5亚组的标记基因在PCa组织中高表达，尤其是在Gleason评分为6或7的患者中，这表明在PCa的发生和早期发展中有潜在的作用（图6a）。通过ROC分析，我们进一步鉴定了5亚组中6个特异性和敏感性最高的标记基因，包括AMACR、GLYATL1、HPN、前列腺癌基因PCA3，前列腺癌相关转录物18（PCAT18）和磷脂酶A2第七组（PLA2G7）（图6b）。基于6-基因集的ROC分析显示了很强的PCa预测能力，AUC得分为0.937。此外，这些基因的表达模式不仅区分了PCa与正常前列腺，而且区分了早期PCa（Gleason评分=6）和高度恶性PCa（Gleason评分≥8）。许多PCa患者在1-2年内表现出抗药性，并复发为晚期PCa，如CRPC。第5亚组可能有助于PCa复发。然而，Kaplan-Meier分析显示，这些基因在生化复发中没有明显的预测能力，无论是单独的还是作为一个基因集（图6c）。总之，第5亚组的恶性细胞是PCa诊断和分层的关键，但与生化复发无关。

Fig6 第5亚组与PCa诊断和分层的临床相关性。

不同病理分级的癌组织之间（图7a）。为了检验强度差异作者进一步用Hscore分析免疫染色评分，发现HPN在癌组织中的表达水平显著增强（图7b）。此外，高病理分级（Gleason评分=7,8,9）的肿瘤组织中HPN的表达水平显著高于病理分级较低（Gleason评分=6）（图7c）。因此，作者认为HPN可能是临床PCa诊断和分层更为特异、敏感的生物标志物。为了探讨HPN在预测PCa复发中的作用，作者根据HPN的表达水平将TCGA患者分为低和高两组，然后分析了治疗依从性标记物的表达，包括ATP结合盒亚家族G成员2（ABCG2）、醛脱氢酶1（ALDH1）、受体酪氨酸激酶（KIT）的表达，活化白细胞粘附分子。

Fig7 PCa组织阵列中HPN表达的验证

结论

本文案例是第一个通过原发性PCa组织的scRNA序列检测PCa异质性的报告。PCa组织由3种不同类型的管腔细胞组成，它们在PCa的发生和发展中具有不同的作用。对PCa诊断和分层至关重要的管腔细胞亚群及其标记基因HPN被鉴定。这项研究结果不仅有助于目前对PCa发生和发展的理解，而且对PCa诊断和分层的标记物的鉴定应用具有潜在的价值。