全长转录组解析淡水花羔红点鲑Toll-like受体和补体系统的免疫作用机制

研究背景

花羔红点鲑是溯河产卵鱼类，在泛太平洋分布。中国东北部山区河流中的花羔红点鲑终身生活在淡水中。早期研究主要集中于花羔红点鲑的生长和地理分布，而对于淡水花羔红点鲑抗细菌感染的免疫系统的影响知之甚少。为了探讨花羔红点鲑适应淡水对其免疫系统的影响，特别是补体系统（complement system）和Toll-like受体（toll-like receptors，TLR）途径的影响，本文对细菌侵染的中国淡水花羔红点鲑进行全长转录组研究。

材料和方法

• 材料
  中国通化市鸭绿江上游支流取鱼（184.6±23.4g），将鱼随机分为两组，腹腔注射嗜水气单胞菌或相应体积的0.9%盐水。
• 全长转录组测序
  腹腔注射后24小时，从细菌注射组中处死3条鱼，收集肝脏和脾脏组织等量混合构建全长转录组文库。
• 测序平台
  北京太阳集团电子游戏科技有限公司PacBio RS II 测序平台，构建3个文库，0-2kb，2-3 kb和3-6 kb。
• qPCR验证
  分别于注射后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h各处死3条鱼，将肝脏和脾脏组织立即液氮速冻，保存-80℃。

 

研究结果

 

1、cDNA文库特征
以中国淡水花羔红点鲑为材料，将细菌注射鱼腹腔法，取肝脏和脾脏等量混样构建cDNA文库测序。去除接头序列和低质量序列（＜50 bp）之后，产生了超过14.88 GB clean data，总数为7,728,364。0-2kb，2-3 kb和3-6 kb分别产生4,565,697、2,087,033和1,075,634 clean data。经过质量控制、数据过滤和去除冗余后，采用31233个高质量转录本获得27,829个转录本。共鉴定出24,541个开放阅读框（ORF），其中17,670个是完整的。

2、转录本的功能注释和分类
对27,829个转录本进行数据库功能富集和分类注释分析，25,809个转录本被注释。NCBI-Nr数据库比对显示，转录本匹配到一系列物种（图1）。Nr数据库中比对上转录本共有25,653个(92.18%)，52.04% 转录本与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）相似，其次是大西洋鲑（Salmo salar）(23.53%)和梭子鱼（Esox lucius）(14.01%)，其余匹配的物种不到10%。GO数据库注释16,612个（59.69%）转录本，富集到两个与免疫相关的亚类，分别是“响应刺激”（3,124个转录本）和“免疫系统过程”（851个转录本）（图2）。将转录本与KEGG数据库比对，共有16917个转录本富集到271个通路。免疫相关的KEGG通路主要包括细胞因子-细胞因子受体相互作用（106个基因）、Toll-like受体信号通路（51个基因）、IgA产生的肠道免疫网络（20个基因）等。

图1 中国花羔红点鲑肝脾cDNA文库Nr注释

图2 转录本GO分类

3、免疫相关基因验证和鉴定
重新测序验证了中国原生淡水花羔红点鲑C4基因（S.m-C4）的完整ORF，长度为5160bp，编码具有1719个氨基酸(aa)残基的蛋白质。通过两两氨基酸序列比较结果显示，Salmo salar与中国花羔红点鲑的同源性最高(94.4%)，相似度最高(88.3%)。
确认了中国原生淡水花羔红点鲑TLR5基因(S.m-TLR5)的cDNA序列。长度为3123 bp，包括207-bp 5’非翻译区域(UTR)， 3’-UTR长度为279 bp，开放阅读框(ORF) 2640 bp编码879个氨基酸(图4)，S.m-TLR5蛋白理论分子量为100.6 kDa。

图4 S.M－TLR5的核苷酸和预测的氨基酸序列

4、多重序列比对
多重序列比对表明，硬骨鱼和人的氨基酸高度保守。推导出的S.m-C4蛋白具有α-β连接子序列RXXR(在残基668-671)和α-γ。连接序列RRXR（残基1426-1429），其中C4氨基酸链被切割成三个链（α，β和γ链）。此外，保守的硫酯（GCGEQ）位点也定位在残基1001至1005（图5）。预测了TLR5由前21个氨基酸组成的信号肽和由14个氨基酸组成的跨膜螺旋。在膜结合型TLR5的LRR-CT中发现4个保守的半胱氨酸残基，此外，还有9个蛋白结合区。结果表明，S.m-TLR5蛋白与银大麻哈鱼（91.5％）、大西洋鲑（91.7％）和衰白鲑（89.6％）的同源性较高，与鲤鱼（48.1％）和金鲫（48.8％）的同源性较低。

图5 中国淡水花羔红点鲑与其它物种C4氨基酸序列的多重比对

5、重建系统发育
为了探究S.m-C4和S.m-TLR5免疫基因在鱼类体内的系统发育情况，中国淡水花羔红点鲑与另外23条硬骨鱼、两条鲨鱼和一条腔棘鱼用于C4基因研究。重建贝叶斯系统发育中，四种鲑鱼形鱼类组合在一起，具有较高的后验概率（PP）(图7)。同时三种鲤形目鱼类和两种鳃形目鱼类分别用1.00 PP进行分组，形成骨鳔总目分支。这一结果与传统分类学和系统发育相一致。硬骨鱼分为鳃形目、原鳃形目、鳃形目和棘鳃目四支，其中，两条鲨鱼是外群。

图7 重建C4基因贝叶斯系统发育

6、分子进化分析
首先，利用位点模型探讨C4基因中是否存在因其不同的分类地位和生存环境而正向选择的位点。在模型中，只有M1a-M2a和M7-M8能够检测到正向选择位点。M7-M8检测到PP > 0.95的10个正向选择位点，其中9个位点也被M1a-M2a检测到，表明鱼C4基因的正向选择。其次，利用分枝模型来探究这些正向选择事件是否发生在特定的鱼类谱系上，从而导致现在的鱼或者祖先鱼类。最后，利用分枝位点模型，在特定的现在和祖先谱系中检测了这些位点。对于C6基因，M7-M8在正选择压力下仅检测到一个位点，而花羔红点斑鲑或其他冷水鱼中的分支位点未检测到任何正选择位点（表8）。

表8 鱼C4和C6基因的位点、分枝和分枝位点模型试验

7、qPCR验证相对表达量
为探讨这两种免疫基因在细菌侵入的免疫应答，采用定量实时PCR（qPCR）技术，观察注射后96h内肝、脾脏相关基因的表达。对于盐水处理组，即对照组，S.m-C4基因在研究的所有时间点肝脏中均无显著差异（图9）。对于嗜水气单胞菌注射组，即实验组，肝脏在24小时有显著增加（p=0.04），在12小时和72小时出现两个峰值，边缘显著。在6h、12h、24h和72h，实验组与对照组有显著性差异。对照组脾脏中S.m-C4基因的相对表达上下波动，8个时间点之间差异不显著，实验组脾脏中S.m-C4基因的相对表达除72h外，其余时间点均无差异，与细菌注射组0 h相比减少59.6%。

图9 嗜水气单胞菌或盐作用肝脏中S.m-C4相对表达量

 

结论

 

1、本研究以细菌侵染后中国淡水花羔红点斑鲑为材料，构建了全长转录组文库。经过质量控制，从31,233个高质量转录本中共获得27,829个转录本，并鉴定出24,541个开放阅读框（ORF），其中17,670个完整。

2、将27,829个转录本用于功能富集和分类分析，25,809个转录本得到注释。相对于适应免疫基因，注释到更多先天免疫相关基因。参与Toll-like受体信号通路的基因多于补体和凝血级联，表明Toll-like受体在细菌侵染的淡水花羔红点鲑中发挥更重要的免疫作用。

3、为验证全长转录组鉴定基因序列准确性，选择S.m-C4和S.m-TLR5进行重新测序验证，进一步证明测序结果的准确性。

4、中国淡水花羔红点鲑中TLR和补体系统显著数量差异，可能是TLR和补体系统进化压力模式的不同所致，以TLR3和TLR5以及C4和C6为代表，它们分别处于纯化选择和正选择压力。

 

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