Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq
发表杂志：PLOS ONE
发表日期：2016-9-26
合作单位：北京农林科学院
研究背景：
细胞质雄性不育（CMS，花粉不育但雌蕊能正常发育）是高等植物中的常见现象，表现为母系遗传。CMS广泛应用于作物杂交育种，以避免额外的人力物力去人工去雄，因此，CMS具有重要的理论和商业价值。植物CMS是由核线粒体相互作用介导的，不育性状的产生来自线粒体基因的表达，但不育性状可以通过核恢复育性基因得到恢复，产生育性部分恢复的表型。目前造成育性不稳定的遗传修饰的分子机制仍然不清楚。本研究欲通过BSR的策略寻找引起玉米育性不稳定的候选基因。
材料选取：
Jing724和 MD32（CMS-S：S型细胞质雄性不育系）为亲本，杂交得到F1群体，再以Jing724为回交亲本，构建BC4群体，群体大小462。选取BC4群体中极端30个完全雄性不育植株的花粉，分别提取RNA，并等量混合构建不育池S，同理选取30个育性部分恢复植株的花粉，构建育性部分恢复池F。
测序平台：Illumina HiseqTM2500，PE125
测序数据：150M clean reads
主要结果：
1、育性分析：FIL-B（育性不稳定系）分为育性部分恢复的植株和完全不育植株，本项目所构建的BC4群体462个子代中有14.9% 的植株为育性部分恢复的表型。育性部分恢复植株的花粉大小小于正常花粉，大于完全不育植株的花粉（Fig 1.）。经I2-KI染色后的不育花粉表现出形态的不规则和染色的异常（Fig 2.）。
Fig 1. FIL-B花粉展示
A：Jing724 和FIL-B （育性不稳定系，包括育性部分恢复植株和完全不育植株） 在抽穗6天后的穗；B： A图中各植株穗上的花粉. 其中红色的标尺代表 3 cm
Fig 2. I2-KI染色后的花粉
A: 正常花粉; B: 育性部分恢复花粉；C：不育花粉
2、显微镜下观察花粉小孢子：在育性部分恢复的植株中只有一部分的小孢子呈现在正常形态，而在不育植株中无正常形态小孢子。（Fig 3.）
Fig 3. 花粉小孢子的显微观察
A: 正常花粉; B: 育性部分恢复花粉；C：不育花粉
3、混池间差异基因分析：本项目以B73为参考基因组，将F池和S池获得的89M和61M clean reads进行比对。F池和S池的唯一比对效率为72.79% 和69.17%，表达的基因数目分别为31,905和31,895。获得混池间的差异基因数目3,672个，在F池中上调表达的有3548个，下调表达的有124个，这些基因共3540个通过NR, Swiss-Prot, GO, COG和 KEGG数据库得到注释。
4、BSR关联分析：与参考基因组比对后，F池和S池分别获得171,594和 170,820个 SNP，选取混池间差异的SNP位点，进行ED关联分析，共得到5个候选区域（Fig 4.），结合数据库注释结果及转录组差异基因的结果，最终获得12个候选基因（Table 2、Table 3）。
Fig 4. ED关联分析结果图
A: 各染色体上SNP的ED值; B: 2号染色体上SNP的ED值；C：各染色体上SNP经拟合后的关联分析结果；B: 2号染色体上SNP经拟合后的的关联分析结果，其中红色的虚线代表阈值线（99百分位法计算得到），黑色的实线代表拟合曲线
5、关联基因的qPCR验证：
本研究选取6个与蛋白相关的候选基因，通过qPCR的方法验证RNA-seq结果。研究发现在育性部分恢复和不育两种表型中，这6个候选基因出现4-8倍不同水平的差异表达。
Fig 5. qPCR验证结果
6、KASP验证：
本研究选取BC4群体中50株育性部分恢复植株和50株不育植株，分别提取DNA，对候选的两个蛋白基因共4个SNP位点进行KASP验证，发现在不同的表型下会出现不同的基因型，再次暗示这两个基因很可能是与育性不稳定相关。
Fig 6. KASP验证结果
文章亮点：
1、研究性状雄性不育在育种工作中具有重大意义，算得上热点研究。
2、BSR定位结果准确：转录组BSR不仅能实现SNP水平的定位，同时能从基因的差异表达水平进一步缩小候选范围，定位结果相对精细。
3、验证内容丰富：从RNA水平（qPCR）和DNA水平（KASP）验证，只为拿到候选基因。
参考文献：
Su A, Song W, Xing J, et al. Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq[J]. PloS one, 2016, 11(9): e0163489.
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